FRET et évaluation de la réparation enzymatique des dommages de l'ADN

Les méthodes classiques pour mesurer l'activité enzymatique de réparation de l'ADN par des glycosylases sont chronophages. Nous avons développé une méthode quantitative basée sur une détection utilisant le principe physique du FRET. Ainsi un substrat d'ADN original est conçu: une "hairpin" contenant des lésions spécifiques, ayant les deux extrémités marquées par des fluorophores. L'excision de la lésion par des glycosylases conduit à la séparation des brins complémentaires, d'ou une diminution du "quenching" de fluorescence. L'excision est quantifiée par l'augmentation de l'intensité du signal d'émission du fluorophore. La validité de ces paramètres a été contrôlée par comparaison avec des méthodes de référence. Les applications du test comme outil de screening pour la détection d'activité sur enzymes purifiées ou à partir d'extraits cellulaires ont été investiguées. Enfin, un projet de miniaturisation en microsystème de type "lab-on-a- chip" a été mené. Les résultats obtenus prouvent la pertinence de notre méthode en phase homogène, en vue d'extensions à l'analyse haut débit (applications en recherche fondamentale, biomédicale et pharmaceutique).

Autorentext

Apres un doctorat de pharmacie obtenu a l'université de Grenoble, Alexia Chollat-Namy synthétise dans ce travail les pistes de recherche qui lui ont été proposées comme axe de réflexion ainsi que les résultats qu'elle a obtenus durant son doctorat en Biotechnologies au CEA de Grenoble.

Klappentext

Les méthodes classiques pour mesurer l'activité enzymatique de réparation de l'ADN par des glycosylases sont chronophages. Nous avons développé une méthode quantitative basée sur une détection utilisant le principe physique du FRET. Ainsi un substrat d'ADN original est conçu: une "hairpin" contenant des lésions spécifiques, ayant les deux extrémités marquées par des fluorophores. L'excision de la lésion par des glycosylases conduit à la séparation des brins complémentaires, d'ou une diminution du "quenching" de fluorescence. L'excision est quantifiée par l'augmentation de l'intensité du signal d'émission du fluorophore. La validité de ces paramètres a été contrôlée par comparaison avec des méthodes de référence. Les applications du test comme outil de screening pour la détection d'activité sur enzymes purifiées ou à partir d'extraits cellulaires ont été investiguées. Enfin, un projet de miniaturisation en microsystème de type "lab-on-a- chip" a été mené. Les résultats obtenus prouvent la pertinence de notre méthode en phase homogène, en vue d'extensions à l'analyse haut débit (applications en recherche fondamentale, biomédicale et pharmaceutique).